Сюжет игры схож с другими скроллинговыми играми о Марио. В New Super Mario Bros. главный персонаж, соответственно, проходит длительный путь и спасает принцессу Пич от Боузера. В течение игры Марио находит несколько полезных предметов — Супергриб, Огненный цветок, а также Суперзвезду, которые позволяют ему обретать уникальные способности и помогают в пути. Во время путешествия через 80 уровней-зон из восьми миров Марио должен победить Боузера-младшего и старшего Боузера, и спасти принцессу.